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Ni-NTA琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联次氮基三乙酸（NTA），再螯合Ni²⁺。与(yu)亚(ya)氨基(ji)二乙酸(suan)（IDA）相(xiang)比，具有更(geng)好的螯(ao)(ao)合剂、还(hai)原剂、碱性(xing)的耐受(shou)性(xing)，如样品中含(han)有1-10mM EDTA或(huo)1-10mM β-巯(qiu)基(ji)乙醇或(huo)5mM DTT，可正(zheng)常纯化；在螯(ao)(ao)合镍的情况(kuang)下，也可以用0.1M NaOH清洗。

Ni-NTA琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni²⁺形成稳定(ding)的配位键，因(yin)此(ci)能特异、牢固、可(ke)逆地吸附于固定(ding)这些(xie)金属(shu)离(li)子的基质，结合了His-Tag重(zhong)组蛋白的Ni-NTA琼脂糖(tang)凝胶FF一般通过增(zeng)加咪(mi)唑浓(nong)度(du)进行(xing)竞争(zheng)洗脱。

技术指标：

使用方法：

1、色谱柱装填

（1）所有需要用到的(de)材料的(de)温度要与色谱操(cao)作的(de)温度一样，液体最好做(zuo)脱气处理。

（2）在柱(zhu)(zhu)子(zi)下端加入蒸(zheng)馏水，以(yi)除去(qu)柱(zhu)(zhu)子(zi)中的(de)(de)空气，关闭柱(zhu)(zhu)子(zi)出口(kou)，在柱(zhu)(zhu)内(nei)保(bao)留少量的(de)(de)蒸(zheng)馏水。

（3）将琼脂糖凝胶连续倒入柱(zhu)子(zi)时，要(yao)用玻璃棒的紧(jin)靠柱(zhu)子(zi)内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。

（4）柱(zhu)(zhu)压(ya)不超过0.3MPa，如果装(zhuang)柱(zhu)(zhu)系(xi)统中无法测柱(zhu)(zhu)压(ya)，则正常流速下填装(zhuang)。

（5）填(tian)装好的(de)Ni-NTA琼脂糖(tang)凝胶FF柱(zhu)(zhu)用2-5个柱(zhu)(zhu)体积的(de)初始(shi)缓冲溶(rong)液平衡，建议流(liu)速(su)100cm/h，平衡后(hou)的(de)柱(zhu)(zhu)子可以(yi)用于(yu)His-Tag重组蛋(dan)白(bai)的(de)上(shang)样(yang)和洗(xi)脱纯化。

2、上样

（1）缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)选(xuan)择：一般(ban)选(xuan)用(yong)(yong)pH6-8的结合缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)，常(chang)用(yong)(yong)缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)有10-00mM 磷酸(suan)钠缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)、20-200mM Tris-HCl缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)等。在缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)中一般(ban)要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除离(li)子交(jiao)换(huan)作(zuo)用(yong)(yong)。在初次使用(yong)(yong)Ni-NTA琼脂(zhi)糖凝胶FF，推(tui)荐(jian)使用(yong)(yong)50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作(zuo)为(wei)结合缓(huan)(huan)(huan)冲(chong)液(ye)(ye)。

（2）样品(pin)(pin)处(chu)理：样品(pin)(pin)的缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)应与(yu)所选结合(he)(he)缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)一(yi)致(zhi)。为保证缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)一(yi)致(zhi)，可以在结合(he)(he)缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)中(zhong)破(po)碎细菌、或(huo)调解pH与(yu)结合(he)(he)缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)一(yi)致(zhi)、或(huo)交换(huan)至结合(he)(he)缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)（常用方(fang)法有透析、超滤(lv)、脱盐柱换(huan)液(ye)(ye)(ye)等(deng)）、或(huo)用结合(he)(he)缓(huan)冲(chong)(chong)液(ye)(ye)(ye)稀释2-10倍等(deng)。样品(pin)(pin)上柱前(qian)应0.45μm过滤(lv)。

3、洗脱

（1）Ni-NTA琼脂糖凝胶FF最(zui)常用的(de)洗(xi)脱方法为增加(jia)咪唑浓度(du)进行洗(xi)脱。

（2）咪唑为碱性，相应(ying)缓冲液配制后需要用HCl进(jin)行调(diao)节pH。

（3）在初次使(shi)用Ni-NTA琼脂糖凝(ning)胶FF，不知道洗(xi)脱(tuo)的咪唑浓(nong)度(du)，建议在结(jie)合(he)缓冲液(ye)中(zhong)分别加(jia)入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，浓(nong)度(du)从低到(dao)高，分别洗(xi)脱(tuo)和收(shou)集，通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗(xi)脱(tuo)组份。

（4）有条件的也可(ke)以进行线性咪唑(zuo)梯度洗(xi)脱(tuo)，确(que)定较(jiao)佳洗(xi)脱(tuo)条件。

4、在位清洗

在多次使用后需要(yao)在位清洗，常用方(fang)法为先5个柱(zhu)体积(ji)(ji)蒸(zheng)馏水(shui)清洗，再(zai)用1-3个柱(zhu)体积(ji)(ji)50mM NaOH清洗10-20min，立(li)即用5个柱(zhu)体积(ji)(ji)结合缓(huan)冲(chong)液（50mM PBS）清洗平衡。

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