相关介绍： 

Ni-TED琼(qiong)(qiong)脂糖(tang)凝胶(jiao)FF以(yi)琼(qiong)(qiong)脂糖(tang)微球(qiu)为基质，通过活化偶联三羧(suo)甲基乙二胺（TED），再螯(ao)合Ni2+。与亚氨基二乙酸（IDA）相比，Ni-TED琼(qiong)(qiong)脂糖(tang)凝胶(jiao)FF具有很(hen)好(hao)的螯(ao)合剂(ji)、还原剂(ji)、碱性的耐(nai)受(shou)性，如样(yang)品中含有10-100mM EDTA或(huo)10-100mM β-巯(qiu)基乙醇或(huo)5-20mM DTT，均可正(zheng)常纯化；无需脱镍，也(ye)可以(yi)用1M NaOH再生(sheng)清洗(xi)。

Ni-TED琼脂糖(tang)凝胶FF主要(yao)用于纯化带组(zu)氨酸标签（His-Tag）的(de)重组(zu)蛋白(bai)。纯化原理是利用重组(zu)蛋白(bai)组(zu)氨酸标签的(de)咪(mi)唑环可与过(guo)渡(du)金属Ni2+形(xing)成稳定(ding)的(de)配位键，因(yin)此能特异(yi)、牢固(gu)、可逆地(di)吸附(fu)于固(gu)定(ding)这些金属离子的(de)基质，结合了His-Tag重组(zu)蛋白(bai)的(de)Ni-TED琼脂糖(tang)凝胶FF一般通过(guo)增(zeng)加咪(mi)唑浓度进行竞争(zheng)洗脱。

技术指标：

使用方法：

1、色谱柱装填

（1）所(suo)有(you)需要用到的材料(liao)的温度(du)(du)要与色谱操(cao)作的温度(du)(du)一样，液体最好做脱气处理(li)。

（2）在柱(zhu)子(zi)下端加入蒸馏(liu)水(shui)，以(yi)除去(qu)柱(zhu)子(zi)中的空气，关闭柱(zhu)子(zi)出口，在柱(zhu)内保留(liu)少量(liang)的蒸馏(liu)水(shui)。

（3）将琼脂糖凝胶(jiao)连(lian)续倒入柱(zhu)子时，要用玻(bo)璃棒的(de)紧靠柱(zhu)子内(nei)壁引流(liu)，以减少气泡的(de)产生(sheng)，让填料(liao)先自(zi)然沉(chen)降(jiang)。

（4）柱压(ya)不超过0.3MPa，如果装柱系统中(zhong)无法测柱压(ya)，则正常(chang)流速下填装。

（5）填装(zhuang)好(hao)的(de)Ni-TED琼脂糖(tang)凝胶FF柱用2-5个(ge)柱体(ti)积的(de)初(chu)始缓(huan)冲(chong)溶液平(ping)衡，建议流速100cm/h，平(ping)衡后的(de)柱子可以用于(yu)His-Tag重组(zu)蛋白的(de)上样和洗(xi)脱纯化。

2、上样

（1）缓(huan)(huan)冲液选(xuan)(xuan)择：一般(ban)选(xuan)(xuan)用pH6-8的(de)结合(he)缓(huan)(huan)冲液，常用缓(huan)(huan)冲液有10-00mM 磷酸钠缓(huan)(huan)冲液、20-200mM Tris-HCl缓(huan)(huan)冲液等。在缓(huan)(huan)冲液中(zhong)一般(ban)要加入0.15-0.5M的(de)NaCl，以消除(chu)离子(zi)交换(huan)作用。在初次使(shi)(shi)用Ni-TED琼脂糖凝(ning)胶FF，推(tui)荐使(shi)(shi)用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为结合(he)缓(huan)(huan)冲液。

（2）样品(pin)处理：样品(pin)的缓冲(chong)液(ye)(ye)应(ying)与所选结(jie)合缓冲(chong)液(ye)(ye)一(yi)致(zhi)。为保证缓冲(chong)液(ye)(ye)一(yi)致(zhi)，可(ke)以(yi)在结(jie)合缓冲(chong)液(ye)(ye)中破碎细菌、或调(diao)解pH与结(jie)合缓冲(chong)液(ye)(ye)一(yi)致(zhi)、或交(jiao)换至(zhi)结(jie)合缓冲(chong)液(ye)(ye)（常用(yong)方法有透析、超滤、脱盐柱(zhu)换液(ye)(ye)等(deng)）、或用(yong)结(jie)合缓冲(chong)液(ye)(ye)稀释2-10倍(bei)等(deng)。样品(pin)上柱(zhu)前应(ying)0.45μm过(guo)滤。

3、洗脱

（1）Ni-TED琼脂糖(tang)凝(ning)胶FF最常(chang)用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。

（2）咪唑为碱(jian)性，相应缓冲液配制(zhi)后需(xu)要用HCl进行调节pH。

（3）在(zai)初次(ci)使用Ni-TED琼脂(zhi)糖凝胶FF，不知道洗脱(tuo)的咪唑浓度(du)，建议在(zai)结(jie)合缓冲液(ye)中分(fen)别加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，浓度(du)从(cong)低到(dao)高，分(fen)别洗脱(tuo)和收集(ji)，通(tong)过SDS-PAGE电泳等方法鉴定(ding)洗脱(tuo)组份。

（4）有条件的也可以进行线性咪唑梯度(du)洗脱，确定较佳洗脱条件。

4、在位清洗

使用完的(de)层析(xi)柱(zhu)出现堵塞、压力增大、流速减慢、载(zai)量下降等情况时，就需(xu)要进(jin)行在位(wei)清(qing)(qing)洗(xi)(xi)。Ni-TED琼脂(zhi)糖凝(ning)胶FF的(de)优势为无需(xu)脱(tuo)镍即(ji)可(ke)用1M NaOH再生清(qing)(qing)洗(xi)(xi)，所以(yi)清(qing)(qing)洗(xi)(xi)最常用的(de)方法(fa)：使用完的(de)层析(xi)柱(zhu)用蒸(zheng)馏(liu)水(shui)(shui)清(qing)(qing)洗(xi)(xi)3-5个(ge)柱(zhu)体积(ji)，然后用1M NaOH清(qing)(qing)洗(xi)(xi)3-5个(ge)柱(zhu)体积(ji)（保(bao)持时间(jian)0.5-1h），然后用蒸(zheng)馏(liu)水(shui)(shui)清(qing)(qing)洗(xi)(xi)至中性即(ji)可(ke)。同其(qi)它层析(xi)介质(zhi)一(yi)样，为了达到更好的(de)清(qing)(qing)洗(xi)(xi)目(mu)的(de)，可(ke)以(yi)采用反向(xiang)清(qing)(qing)洗(xi)(xi)；如需(xu)去除热源，可(ke)在1M NaOH中保(bao)持更长时间(jian)（1-2h）。

除了NaOH清洗(xi)外，强电荷蛋白(bai)(bai)可以(yi)用1-2M NaCl进(jin)行清洗(xi)；脂(zhi)类、脂(zhi)蛋白(bai)(bai)、强疏(shu)水蛋白(bai)(bai)可以(yi)用30%异丙醇（或70%乙醇）进(jin)行清洗(xi)。

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