相关介绍： 

　　螯(ao)合(he)(he)金(jin)属(shu)(shu)离子(zi)亲和层析（IMAC）琼(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝胶(jiao)(jiao)FF具(ju)有螯(ao)合(he)(he)金(jin)属(shu)(shu)离子(zi)的能(neng)力，如螯(ao)合(he)(he)Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+等，螯(ao)合(he)(he)金(jin)属(shu)(shu)离子(zi)后可用于(yu)富含(han)组(zu)氨(an)酸、色(se)氨(an)酸、半胱氨(an)酸的蛋(dan)白质(zhi)纯(chun)(chun)(chun)化(hua)，其中最常(chang)见的是用于(yu)融(rong)合(he)(he)了6-8个(ge)组(zu)氨(an)酸标(biao)签的蛋(dan)白质(zhi)纯(chun)(chun)(chun)化(hua)。与(yu)IDA琼(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝胶(jiao)(jiao)FF相比，IMAC琼(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝胶(jiao)(jiao)FF一般可以(yi)更牢(lao)固的结合(he)(he)金(jin)属(shu)(shu)离子(zi)，在(zai)纯(chun)(chun)(chun)化(hua)标(biao)签蛋(dan)白方面，有可能(neng)获得更高纯(chun)(chun)(chun)度的样(yang)品。

技术指标：

使用方法：

1、色谱柱装填

（1）所(suo)有需要用(yong)到的(de)材料的(de)温度要与色谱操(cao)作的(de)温度一样，液体(ti)最好(hao)做(zuo)脱气(qi)处理。

（2）在柱子(zi)下端(duan)加(jia)入(ru)蒸馏水(shui)，以除去柱子(zi)中(zhong)的(de)空气(qi)，关闭(bi)柱子(zi)出口，在柱内保留少量的(de)蒸馏水(shui)。

（3）将琼脂糖(tang)凝胶连续(xu)倒(dao)入柱(zhu)子时，要(yao)用玻(bo)璃棒的(de)(de)紧靠柱(zhu)子内(nei)壁(bi)引流，以减少气泡的(de)(de)产(chan)生，让(rang)填料先自然沉降，建议柱(zhu)床高度不超(chao)过20cm。

（4）柱压(ya)不超过0.3MPa，如果装柱系(xi)统中无法测柱压(ya)，则正常使用流速填装。

（5）填装好的(de)IMAC琼脂糖凝胶FF柱用(yong)5个柱体积(ji)蒸馏水(shui)清(qing)洗，使(shi)用(yong)的(de)流速建议为(wei)100cm/h。

2 螯合金属离子

（1）根据需要选择金属(shu)(shu)盐(yan)，一(yi)(yi)般(ban)配置0.1-0.2M金属(shu)(shu)盐(yan)溶液，常(chang)见的有CuSO4、ZnSO4、NiSO4、CoCl2等。注意(yi)金属(shu)(shu)盐(yan)溶液的pH以偏酸性为宜（如pH4-6，Fe3+一(yi)(yi)般(ban)需要pH3），防止在螯合时(shi)pH上升(sheng)产生沉淀。

（2）蒸馏水清(qing)洗后(hou)的(de)IMAC琼脂糖凝胶FF用1-3个柱(zhu)体(ti)积(ji)金(jin)(jin)属(shu)盐溶液(ye)过柱(zhu)螯(ao)合金(jin)(jin)属(shu)离(li)子，然后(hou)用5个柱(zhu)体(ti)积(ji)以上的(de)蒸馏水清(qing)洗层析柱(zhu)，去除游离(li)的(de)金(jin)(jin)属(shu)盐溶液(ye)。

（3）用5个柱(zhu)体积以上(shang)的(de)乙(yi)酸(suan)(suan)缓冲液（20mM 乙(yi)酸(suan)(suan)-乙(yi)酸(suan)(suan)钠(na)，1M 氯化钠(na)，pH4.0）清洗，去除结合不牢固(gu)的(de)金(jin)属(shu)离子(zi)，减少(shao)在使用过程的(de)脱落。

（4）处理完(wan)后(hou)可用结合缓冲液(ye)平衡层析柱，用于目标蛋白的纯化(hua)。

3、纯化目标蛋白

（1）选(xuan)择缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)：一般(ban)选(xuan)用(yong)(yong)pH6-8的结合(he)缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)，常用(yong)(yong)缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)有10-00mM 磷酸(suan)钠缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)、20-200mM Tris-HCl缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)等。在缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)中一般(ban)要加入0.15-0.5M的NaCl，以消(xiao)除(chu)离子交(jiao)换作用(yong)(yong)。在初次(ci)使用(yong)(yong)IMAC琼脂糖(tang)凝胶(jiao)FF，推(tui)荐使用(yong)(yong)50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为结合(he)缓(huan)(huan)(huan)(huan)冲液(ye)。

（2）样(yang)(yang)品(pin)(pin)处理：样(yang)(yang)品(pin)(pin)的缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)应(ying)与所选结合缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)一致。为保证(zheng)缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)一致，可以在(zai)结合缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)中破碎细菌、或(huo)调解pH与结合缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)一致、或(huo)交换(huan)至(zhi)结合缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)（常用(yong)方法有透析、超滤(lv)、脱(tuo)盐柱(zhu)换(huan)液(ye)(ye)(ye)等(deng)）、或(huo)用(yong)结合缓(huan)冲液(ye)(ye)(ye)稀释2-10倍等(deng)。样(yang)(yang)品(pin)(pin)上柱(zhu)前应(ying)0.45μm过滤(lv)。

（3）平(ping)衡上样：螯合(he)金属离子的IMAC琼脂糖凝胶FF用(yong)结(jie)合(he)缓(huan)冲液平(ping)衡5个柱(zhu)体积(ji)，然(ran)后将样品(pin)上柱(zhu)，上完样后，用(yong)结(jie)合(he)缓(huan)冲液平(ping)衡。

（4）洗(xi)脱(tuo)优化：螯(ao)合(he)金属离子的(de)IMAC琼脂糖凝(ning)胶FF最常用(yong)的(de)洗(xi)脱(tuo)方(fang)法(fa)(fa)为增(zeng)加(jia)咪(mi)唑浓(nong)度(du)(du)进行(xing)洗(xi)脱(tuo)。初次实(shi)验不知道洗(xi)脱(tuo)的(de)咪(mi)唑浓(nong)度(du)(du)，可尝试不同的(de)浓(nong)度(du)(du)洗(xi)脱(tuo)，建(jian)议在结合(he)缓(huan)冲液中分别加(jia)入(ru)5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪(mi)唑（咪(mi)唑为碱(jian)性物质(zhi)，加(jia)入(ru)咪(mi)唑后需重新调节pH），浓(nong)度(du)(du)从低到(dao)高，先后分别洗(xi)脱(tuo)和收(shou)集，通(tong)过(guo)SDS-PAGE电(dian)泳等(deng)方(fang)法(fa)(fa)鉴(jian)定(ding)洗(xi)脱(tuo)组份(fen)。

4、再生清洗

（1）多次(ci)使(shi)用(yong)后或需要更换螯合的金属(shu)离子(zi)，必须(xu)将凝(ning)胶脱去金属(shu)离子(zi)再(zai)生。脱金属(shu)离子(zi)方(fang)法：用(yong)5-10个柱体积蒸馏水淋洗(xi)柱子(zi)，再(zai)用(yong)10个以上(shang)柱体积的100 mM EDTA淋洗(xi)柱子(zi)，再(zai)用(yong)3-5个柱体积的0.5M NaCl洗(xi)掉残留的EDTA。

（2）多次使用的(de)柱子脱镍后一般需要清(qing)洗。清(qing)洗方法：用0.1-1.0M NaOH反向(xiang)清(qing)洗柱子，流速50cm/h，保持1-2h，能去(qu)除结合强的(de)杂(za)质(zhi)，同时也能去(qu)除热源。NaOH清(qing)洗后应立即用5个柱体积(ji)以上(shang)的(de)蒸馏水清(qing)洗至中性，清(qing)洗后可按照螯合金(jin)属(shu)(shu)离子的(de)方法重新螯合金(jin)属(shu)(shu)离子。

5、保存

IMAC琼(qiong)脂糖(tang)凝胶FF和螯合金(jin)属离子(zi)后的(de)IMAC琼(qiong)脂糖(tang)凝胶FF都可以用20%乙醇(chun)(chun)保存，一般蒸馏水清洗后，用3个(ge)柱体积(ji)20%乙醇(chun)(chun)清洗。20%乙醇(chun)(chun)清洗后的(de)层析柱和凝胶可放置(zhi)在2-25℃条件下保存。