相关介绍： 

镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），再螯合Ni²⁺。其(qi)中IDA是金属螯(ao)合层析中最常(chang)用的配体，与次氮基三乙酸（NTA）相比，具(ju)有亲和力强，载量(liang)高，可再(zai)生重复使用的特(te)点。

镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni²⁺形成(cheng)稳定(ding)的(de)配位键，因此能(neng)特异、牢固、可(ke)逆地吸(xi)附于(yu)固定(ding)这些金属离(li)子的(de)基质，结合了(le)His-Tag重组蛋(dan)白(bai)的(de)镍-琼脂糖(tang)凝(ning)胶FF一般通过增加咪唑(zuo)浓度进行(xing)竞争洗脱(tuo)。

技术指标：

使用方法：

1.色谱柱装填

1.1 所有需要用到(dao)的(de)材料的(de)温(wen)度要与色谱操作的(de)温(wen)度一(yi)至，液体最好(hao)做脱气处理。

1.2 在(zai)柱子下端加(jia)入蒸(zheng)馏(liu)水，以(yi)除去柱子中的(de)空气，关(guan)闭柱子出口，在(zai)柱内保留少量的(de)蒸(zheng)馏(liu)水。

1.3 将(jiang)琼(qiong)脂糖凝(ning)胶连续倒入(ru)柱子(zi)时(shi)，要(yao)用玻璃(li)棒的紧(jin)靠柱子(zi)内(nei)壁(bi)引流(liu)，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降。

1.4 柱压不(bu)超过0.3 MPa，如(ru)果装柱系(xi)统(tong)中(zhong)无法(fa)测柱压，则控制流速(su)高于300 cm/h，但是在使用中(zhong)一般(ban)只(zhi)用最大(da)流速(su)的(de)75%。

1.5填装好(hao)的(de)镍-琼脂糖凝胶FF柱(zhu)用2 ~ 5个柱(zhu)体积的(de)初(chu)始缓冲溶液平衡(heng)，建(jian)议流速100 cm/h，平衡(heng)后的(de)柱(zhu)子可以用于His-Tag重组蛋白(bai)的(de)上样和洗脱纯化。

2.上样

2.1 样品一般溶解在pH6 ~ 8的(de)初始缓冲液中，提高上样缓冲液的(de)pH值，可以增(zeng)大(da)载(zai)量。

2.2 缓冲(chong)液中(zhong)不能含(han)有EDTA和柠檬(meng)酸盐，也(ye)最好不含(han)巯基乙醇、DTT等还(hai)原剂(ji)。

2.3常(chang)用缓(huan)冲液(ye)有10 ~ 100 mM 磷酸钠缓(huan)冲液(ye)、20 ~ 200 mM Tris-HCl缓(huan)冲液(ye)等。

2.4在(zai)缓冲液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的(de)NaCl，以消(xiao)除离子(zi)交换(huan)作用。

2.5在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，NaOH调(diao)节pH 7.4）作(zuo)为初始缓冲液。

3. 洗脱

3.1 镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增(zeng)加咪唑浓度进行洗脱。

3.2咪(mi)唑为(wei)碱性，相应缓冲液配制后需要(yao)用HCl进行调节pH。

3.3在初(chu)次使用镍-琼脂糖凝胶FF，不(bu)知道洗脱(tuo)的咪唑浓度，推荐在初(chu)始缓冲(chong)液(ye)中分(fen)别(bie)加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从(cong)低到高，分(fen)别(bie)洗脱(tuo)和收集，通过(guo)SDS-PAGE电泳等方法(fa)鉴(jian)定。

3.4 有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗(xi)脱，确定较佳洗(xi)脱条件。

拓展应用：

1. 更换不同的螯合离子

1.1 IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱掉镍，脱掉镍后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH进行清洗凝胶，再重新螯合镍，使凝胶焕然一新。也可以螯合其他金属离子，如Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Fe³⁺等，进行多样纯化。

1.2 脱镍方法：用5 ~ 10个(ge)柱体积蒸馏水淋洗柱子(zi)，再用5 ~ 10个(ge)柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子(zi)，再用2 ~ 3个(ge)柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.3螯合(he)(he)金(jin)属离子(zi)方法：用(yong)2 ~ 5个柱(zhu)(zhu)体积(ji)(ji)的蒸(zheng)馏水充(chong)分平衡脱镍的柱(zhu)(zhu)子(zi)，用(yong)0.1 ~ 0.3M金(jin)属盐溶液过柱(zhu)(zhu)5 ~ 10个柱(zhu)(zhu)体积(ji)(ji)螯合(he)(he)金(jin)属，螯合(he)(he)后用(yong)5 ~ 10个柱(zhu)(zhu)体积(ji)(ji)蒸(zheng)馏水淋(lin)洗，去除未(wei)螯合(he)(he)的金(jin)属离子(zi)。

1.4 金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐，如为NiSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、PbSO₄等，金属(shu)盐(yan)溶(rong)液应(ying)中性或弱酸(suan)性，且必须经过(guo)过(guo)滤，以(yi)防止金属(shu)盐(yan)在胶上沉淀。

1.5 如果是Fe³⁺必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe³⁺产生沉淀，一般可以(yi)加入少量盐酸(suan)和硫酸(suan)保(bao)持pH。

2. 多种洗脱方法

2.1 降低pH洗脱：大多(duo)数蛋白(bai)在pH 4 ~ 6会被洗脱下来，也可以(yi)在pH 3 ~ 4，缓冲液(ye)可以(yi)是醋酸(suan)钠、柠檬酸(suan)或磷酸(suan)盐缓冲体系。

2.2 竞争(zheng)性洗脱：线性增加(jia)或一步增加(jia)与金属离子(zi)有亲(qin)和力的(de)物质(zhi)，如0 ~ 0.5 M咪唑，0 ~ 50 mM组氨(an)酸，0 ~ 2 M NH4Cl。梯度洗脱最好在起始(shi)缓冲(chong)液的(de)恒定pH下(xia)进行。

2.3 螯合(he)(he)剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合(he)(he)剂会与金属离子(zi)产生作用力，导致蛋(dan)白被洗脱下来。这种方法不(bu)能使不(bu)同的蛋(dan)白分(fen)离，此外(wai)会影响(xiang)蛋(dan)白吸附，导致融合(he)(he)蛋(dan)白不(bu)能挂柱。

2.4 所有上述情况中，缓(huan)冲液中必须加(jia)入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以(yi)消(xiao)除离子(zi)交换作用(yong)。

2.5 当螯合离子配基是Cu²⁺时(shi)，有以下的三种操(cao)作方式。

降低pH洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 3.5

竞争性洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NH4Cl，pH 7.4

螯合剂洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4

注：配(pei)制的缓冲(chong)液需要用(yong)NaOH或HCl调节至要求的pH。使(shi)用(yong)降低(di)pH和螯合剂(ji)洗脱会使(shi)金(jin)属(shu)离子脱落，下次使(shi)用(yong)得重新(xin)螯和金(jin)属(shu)离子，最常用(yong)的为竞(jing)争(zheng)性洗脱。

再生、清洗：

1. 凝胶的再生

1.1 多(duo)次使用后或需要更换(huan)螯合的(de)金属离(li)子，必须将(jiang)胶(jiao)脱镍再生。脱镍方(fang)法(fa)：用5 ~ 10个柱(zhu)体(ti)(ti)积(ji)(ji)蒸馏(liu)水淋洗(xi)柱(zhu)子，再用5 ~ 10个柱(zhu)体(ti)(ti)积(ji)(ji)的(de)100 mM EDTA淋洗(xi)柱(zhu)子，再用2 ~ 3个柱(zhu)体(ti)(ti)积(ji)(ji)的(de)0.5 M NaCl洗(xi)掉残留的(de)EDTA。

1.2 多次使(shi)用的柱子脱镍(nie)后一般需要清(qing)洗。清(qing)洗方法：用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清(qing)洗柱子，流速50 cm/h，保持(chi)1 ~ 2 h，能去除结合强的杂质，同时也(ye)能去除热源。

1.3 清洗(xi)后(hou)需要重新螯(ao)合(he)金属(shu)离子(zi)。螯(ao)合(he)方(fang)法(fa)：用2 ~ 5个(ge)柱(zhu)体(ti)积的蒸馏(liu)水(shui)充分平衡脱镍的柱(zhu)子(zi)，用0.1 ~ 0.3M金属(shu)盐溶液过柱(zhu)5 ~ 10个(ge)柱(zhu)体(ti)积螯(ao)合(he)金属(shu)，螯(ao)合(he)后(hou)用5 ~ 10个(ge)柱(zhu)体(ti)积蒸馏(liu)水(shui)淋洗(xi)，去除未(wei)螯(ao)合(he)的金属(shu)离子(zi)。

2.在位清洗

2.1 除去因离子交换(huan)作用吸附(fu)的蛋白，用2 ~ 3个柱体积2 M 的NaCl溶液(ye)反向清洗柱子。

2.2 除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4个柱(zhu)体积的70%的乙醇(chun)或者30%的异(yi)丙醇(chun)反向清洗柱(zhu)子。

2.3 除去蛋白沉淀(dian)、疏水性蛋白，参照凝胶的(de)再(zai)生。

注意事项：

导购指南